Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) – do identyfikowania barwników organicznych

Dysponent: Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska

Kontakt: dr hab. inż. Katarzyna Lech, prof. PW 

Opis metody

Wysokosprawna chromatografia cieczowa połączona z detektorem tandemowej spektrometrii mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie (HPLC-ESI MS/MS) to technika pozwalająca na rozdzielenie i identyfikację naturalnych związków barwiących wchodzących w skład barwników organicznych (pochodzenia naturalnego i syntetycznego) stosowanych w obiektach zabytkowych. Dodatkowo technika ta jest wspomagana przez detektor spektrofotometryczny UV-Vis (umieszczony pomiędzy jednostkami HPLC i MS), co wspomaga detekcję związków barwnych.

Zastosowanie układu chromatograficznego pozwala na rozdzielenie związków barwnych wchodzących w skład złożonej mieszaniny pochodzącej od różnych preparatów barwiących w zależności od właściwości fizyko-chemicznych tych związków. Związki opuszczające kolumnę chromatograficzną są trafiają do detektora, który rejestruje ich obecność w postaci pików na chromatogramach (Rys. 1). Podstawią identyfikacji tych związków jest czas retencji (tj. czasy przebywania związku wewnątrz kolumny chromatograficznej), który jest dla niego charakterystyczny i podlega porównywaniu z czasami retencji odpowiednich substancji wzorcowych.

W badaniach barwników organicznych są stosowane dwa detektory połączone szeregowo, tj. detektor spektrofotometryczny i detektor spektrometrii mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie. Zastosowanie detektora spektrofotometycznego UV-Vis umożliwia rejestrację pików związków barwnych, natomiast spektrometr mas pozwala je zidentyfikować w oparciu o stosunek ich masy do ładunku (m/z). Cząsteczki obojętne związków wprowadzanych do spektrometru mas ulegają w nim jonizacji, a następnie są „filtrowane” (rozdzielane) zgodnie z ich wartością m/z, co jest podstawą ich identyfikacji. Zastosowanie tandemowego spektrometru mas (MS/MS) pozwala też poddać związek fragmentacji, w wyniku czego z jednej strony można znacznie poprawić czułość metody pomiarowej (prowadzić badania jeszcze mniejszych próbkach), z drugiej zaś można zarejestrować tzw. widmo jonów potomnych, stanowiące swoisty „odcisk palca” badanego związku. Widmo takie umożliwia bezwzorcową identyfikację nawet nieznanych substancji.

Zastosowanie

W dziedzinie badania obiektów zabytkowych metoda znajduje zastosowanie przede wszystkim do:

• identyfikacji organicznych barwników naturalnych i syntetycznych głównie w tkaninach i włóknach, atramentach, na papierze, pergaminach, a także w pigmentach i warstwach malarskich (analiza porównawcza w oparciu o bazę wzorców),
• identyfikacji nieznanych organicznych związków barwiących spoza bazy wzorców w oparciu o bezwzorcową identyfikacja na podstawie widm MS/MS.

Technika HPLC-UV-Vis-ESI MS/MS jest techniką inwazyjną i niszczącą, a zatem wymaga ona pobrania próbki. Z uwagi jednak na wysoką czułość opracowanej metody, ilość próbki potrzebna do przeprowadzenia badań jest bardzo niewielka (w przypadku tkanin może być to nić o długości od 1-10 mm, ok. 0,5-2.0 mg w zależności od obiektu, jego stanu zachowania i intensywności barwy), a badania można prowadzić nawet dla wyblakłych, bądź zniszczonych obiektów, zawierających śladową ilość oryginalnych związków barwiących.

Możliwość identyfikacji barwników organicznych jest ograniczona do tych znajdujących się w bazie danych. W zależności od rodzaju stosowanego barwnika można ustalić:

• dokładnych gatunek preparatu wyżytego do barwienia;
• grupę barwników charakteryzującą się identyczną lub bardzo podobną gamą zawartych w nich związków barwiących, ze wskazaniem rodzaju/rodziny lecz bez rozróżnienia gatunkowego.

W niektórych przypadkach ustalenia te mogą pomóc w datowaniu obiektu lub ustalaniu jego proweniencji.

Instrument

Badania prowadzone są za pomocą układu składającego się z:

• pompy chromatograficznej HPLC Agilent Technologies 1100 Series,
• detektora UV-Vis jednowiązkowy VWD Agilent Technologies 1100 Series z lampą 190 – 600 nm,
• detektora UV-Vis typu DAD HP Technologies 1100 Series z lampą 190 – 950 nm,
• tandemowego spektrometru mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie ESI MS/MS Agilent Technologies 6460 z systemem JetStream.

Warunki badania

Do wykonania badań konieczne jest pobranie niewielkiej próbki niewielka (w przypadku tkanin może być to nić o długości od 1-10 mm, ok. 0,5-2.0 mg w zależności od obiektu, jego stanu zachowania i intensywności barwy). Organiczne związki barwiące są z niej ekstrahowane za pomocą polarnych rozpuszczalników (Rys. 2), a następnie są one rozdzielane i identyfikowane z użyciem układu HPLC-UV-Vis-ESI MS/MS (zarówno w trybie jonów dodatnich, jaki i ujemnych).

Pełna identyfikacja barwników organicznych w próbce wymaga przeprowadzenia czterech analizy każdej próbki. Jedna analiza trwa ok. 45 minut.

Ponieważ jest to technika niszcząca próbkę (uzyskany ekstrakt jest zużywany podczas analiz), badania identyfikacji barwników organicznych powinny być prowadzone na końcu, po przeprowadzeniu pozostałych badań. Resztki próbki po ekstrakcji mogą nie kwalifikować się do kolejnych badań.

Format wyników pomiarów

Dysponent obiektu otrzymuje wyniki pomiarów w postaci raportu zawierającego chromatogramy oraz ich podstawową interpretację. W przypadku przygotowywania wyników do publikacji mogą być opracowane dodatkowe ilustracje, przygotowane zgodnie z wymogami edytora.

Przykładowe wyniki badań przeprowadzonych z użyciem zestawu aparaturowego HPLC-UV-Vis-ESI MS można znaleźć w publikacjach:

1. Lech, “Analysing reds in Coptic textiles: Insights from mass spectrometry”, Journal of Cultural Heritage 71, 274-281 , (2025), DOI:10.1016/j.culher.2024.12.007
2. Martyka, K. Lech, „Badania kolorystyki tekstyliów ze średniowiecznego cmentarzyska pruskiego w Równinie Dolnej (pow. kętrzyński)”, Pomorania Antiqua XXXIII, 239-268, (2024).
3. Lech, „Sekrety barw, czyli sztuka tekstylna okiem chemika” w: Tkanina – cenne dziedzictwo, przedmiot współczesnych badań / Stanilewicz Karolina (red.), Akademia Sztuk Pięknych im. Władysława Strzemińskiego w Łodzi, 2021, str. 143-158, ISBN 978-83-66037-77-9
4. Lech, J. Nawała, S. Popiel, „Mass Spectrometry for Investigation of Natural Dyes in Historical Textiles: Unveiling the Mystery behind Safflower-Dyed Fibers”, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 32, 2552-2566, (2021), DOI:10.1021/jasms.1c00195
5. Lech, „Universal analytical method for characterization of yellow and related natural dyes in liturgical vestments from Krakow”, Journal of Cultural Heritage 46, 108-118, (2020), DOI: 10.1016/j.culher.2020.04.011
6. Lech, „Dataset supporting the Identification of natural dyes in yellow, orange, brown and Green fibres from Krakow liturgical vestments”, Data Brief 31, 105735, (2020), DOI: 10.1016/j.dib.2020.105735
7. Lech, „Współczesne spojrzenie na XV-wieczny ornat – wstępna identyfikacja barwników za pomocą HPLC-UV-Vis-ESI MS/MS”, [w:] B. Kalfas (Ed.), Konserwacja tkanin ze skarbca katedry na Wawelu dawniej i dziś. Biblioteka Kapitulna na Wawelu, t. 9, Archiwum i Biblioteka Krakowskiej Kapituły Katedralnej, Kraków, 2017, str. 305-320
8. Krupa, K. Lech, „Identyfikacja barwników naturalnych występujących w wybranych aksamitnych tekstyliach z XV i XVI w. ze skarbca katedry na Wawelu”, [w:] J. Urban, E. Zych (Ed.), Klejnot w koronie. 650-lecie konsekracji katedry krakowskiej, Archiwum i Biblioteka Krakowskiej Kapituły Katedralnej, Kraków, 2017, str. 605-622
9. Lech, M. Jarosz, „Identification of Polish cochineal (Porphyrophora polonica L.) in historical textiles by high-performance liquid chromatography coupled with spectrophotometric and tandem mass spectrometric detection”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 408, 3349-3358, (2016), DOI: 10.1007/s00216-016-9408-0
10. Lech, K. Witkoś, B. Wileńska, M. Jarosz, „Identification of unknown colorants in pre-Columbian textiles dyed with American cochineal (Dactylopius coccus Costa) using high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 407, 855-867, (2015), DOI: 10.1007/s00216-014-8107-y
11. Lech, E. Wilicka, J. Witowska-Jarosz, M. Jarosz, „Early synthetic dyes – a challenge for tandem mass spectrometry” Journal of Mass Spectrometry 48, 141-147, (2013), DOI: 10.1002/jms.3090